蛋白層析柱高效使用與精準(zhǔn)維護(hù)攻略

一、裝柱與平衡階段注意事項(xiàng)  

層析柱預(yù)處理  

清潔與滅菌：使用前，用去離子水沖洗柱管及配件，去除雜質(zhì)；需滅菌時(shí)，采用高壓蒸汽滅菌（121℃，20分鐘）或乙醇浸泡（75%乙醇，≥30分鐘），確保無(wú)菌環(huán)境。  

墊片與篩板檢查：檢查篩板是否平整、無(wú)破損，墊片需緊密貼合柱壁，避免漏液或蛋白泄漏。  

填料裝填技巧  

填料預(yù)處理：根據(jù)說(shuō)明書(shū)，用緩沖液平衡填料（如Sepharose需懸浮于20%乙醇），去除氣泡并調(diào)整至合適濃度（如10-50%懸浮液）。  

裝柱方法：  

采用“濕法裝柱”，緩慢倒入填料，避免分層或氣泡。  

裝填后用緩沖液輕柔沖洗，流速≤1ml/min（小柱）至≤10ml/min（大柱），直至基線(xiàn)平穩(wěn)（UV280nm吸收值≤0.01AU）。  

平衡條件優(yōu)化  

緩沖液選擇：與樣品緩沖液成分一致（如pH、離子強(qiáng)度），避免蛋白沉淀或變性。  

平衡體積：至少5倍柱體積（CV），復(fù)雜填料（如離子交換）需10-15倍CV，確保填料表面電荷或配基充分平衡。  
 

二、蛋白層析柱上樣與洗脫階段注意事項(xiàng)  

樣品預(yù)處理  

澄清過(guò)濾：樣品需經(jīng)0.22μm或0.45μm濾膜過(guò)濾，去除顆粒物，防止堵塞篩板。  

濃度與體積：上樣量≤填料動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（如DEAE填料蛋白載量10-50mg/ml），體積≤5%柱體積，避免過(guò)載導(dǎo)致峰形展寬。  

流速與壓力控制  

操作壓力：維持柱壓≤0.3MPa（常規(guī)柱），壓力驟升（＞0.5MPa）需立即停泵，檢查是否堵塞。  

流速優(yōu)化：  

分子篩層析：流速0.5-2ml/min（小柱），保持線(xiàn)性流速≤150cm/h。  

離子交換/親和層析：流速1-5ml/min，平衡與洗脫流速需一致。  

洗脫策略  

梯度洗脫：離子交換層析采用線(xiàn)性鹽梯度（如0-1MNaCl），親和層析用競(jìng)爭(zhēng)性洗脫液（如咪唑、甘氨酸），需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳梯度。  

收集管理：按峰收集，每管體積≤1/10柱體積，合并主峰并檢測(cè)蛋白濃度（如Bradford法）。  

三、清洗與再生注意事項(xiàng)  

常規(guī)清洗  

緩沖液沖洗：每次運(yùn)行后，用2-3倍CV起始緩沖液沖洗，去除殘留蛋白。  

高鹽清洗：離子交換柱用1-2MNaCl沖洗，去除非特異性結(jié)合蛋白。  

深度再生  

酸堿處理：  

離子交換柱：0.1-0.5MNaOH（堿性填料）或0.1-1MHCl（酸性填料），浸泡30分鐘至2小時(shí)。  

親和柱：根據(jù)配基特性選擇（如His標(biāo)簽柱用0.1MEDTA解離金屬離子）。  

有機(jī)溶劑清洗：疏水層析柱可用20-50%乙醇沖洗，去除脂類(lèi)或疏水性雜質(zhì)。  

消毒與保存  

消毒：長(zhǎng)期存放前，用0.02%疊氮鈉或20%乙醇沖洗并保存，防止微生物污染。  

凍存：特殊填料（如抗體親和柱）可凍存于-20℃（含50%甘油），但需驗(yàn)證填料穩(wěn)定性。  

四、蛋白層析柱常見(jiàn)問(wèn)題與避坑指南  

峰形異常處理  

拖尾峰：可能原因包括填料過(guò)載、流速過(guò)快或柱效下降。解決方法：減少上樣量、降低流速或更換新柱。  

肩峰或分裂峰：填料不均一或樣品聚集導(dǎo)致。解決方法：重新裝柱或優(yōu)化樣品緩沖液（如添加助溶劑）。  

柱效下降應(yīng)對(duì)  

柱壓升高：篩板堵塞時(shí)，反向沖洗（低流速）或更換篩板；填料壓實(shí)則需重新裝柱。  

分辨率降低：填料老化需更換，或優(yōu)化緩沖液條件（如pH、離子強(qiáng)度）。  

蛋白損失預(yù)防  

非特異性吸附：增加平衡體積或添加非離子去污劑（如0.05%Tween-20）。  

機(jī)械泄漏：定期檢查柱接頭、墊片，緊固或更換密封件。